Enzymatyczne usuwanie NLPZ z wody – skuteczna metoda oczyszczania

Czy NLPZ zagrażają zdrowiu i środowisku?

Enzymatyczne usuwanie niesteroidowych leków przeciwzapalnych z wody – skuteczne rozwiązanie dla narastającego problemu środowiskowego

Niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ), takie jak diklofenak (DCF) i aceklofenak (ACF), należą do najczęściej stosowanych farmaceutyków zarówno w medycynie ludzkiej, jak i weterynaryjnej. W samych Stanach Zjednoczonych rocznie wystawianych jest ponad 70 milionów recept na te leki, a zużycie osiąga ponad 30 miliardów dawek. Unia Europejska, będąca drugim największym konsumentem tych leków, zużywa 50-150 g NLPZ na osobę rocznie, co stanowi około 24% światowego zużycia. Te imponujące statystyki mają jednak swoją ciemną stronę – NLPZ coraz częściej wykrywane są w wodach morskich, powierzchniowych i gruntowych, a także w osadach ściekowych oraz ściekach przemysłowych i szpitalnych.

Obecność tych substancji w środowisku wodnym stanowi poważny problem, ponieważ konwencjonalne metody oczyszczania ścieków nie są w stanie skutecznie ich usunąć. Badania wykazały, że DCF był wykrywany w ściekach oczyszczalni w stężeniu 349 ng/L dla związku macierzystego i 237 ng/L dla jego metabolitu 4′-hydroksy (wskaźnik usuwania przez osad wynosił zaledwie 21%). ACF wykryto w stężeniach 31 i 59 ng/L odpowiednio jako związek macierzysty i metabolit 4′-hydroksy. Co istotne, ACF był stosunkowo łatwo hydrolizowany do DCF w procesie osadu czynnego. Nowsze badania wykazały obecność DCF w ściekach oczyszczalni w stężeniu aż 647 ng/L. W efekcie, nawet w tak niskich stężeniach jak ng/L do μg/L, NLPZ mogą negatywnie wpływać na zdrowie, zachowanie, reprodukcję i przeżywalność organizmów wodnych na różnych poziomach troficznych. “Nasze badania jednoznacznie wskazują, że NLPZ stanowią istotny problem środowiskowy o szkodliwych konsekwencjach dla ekologii, flory i fauny, a także ludzi” – podkreślają autorzy badania.

Jakie warunki decydują o skuteczności enzymatycznego usuwania NLPZ?

W odpowiedzi na ten problem, naukowcy podjęli badania nad wykorzystaniem peroksydazy z łupiny nasion soi (SBP) do enzymatycznego oczyszczania wody z tych farmaceutyków. Metoda ta opiera się na zdolności enzymu do katalizowania utleniania różnych związków, co prowadzi do tworzenia reaktywnych rodników. Te rodniki łączą się następnie nieenzymatycznie, tworząc dimery, które rosną do momentu osiągnięcia limitu rozpuszczalności i wytrącają się, co umożliwia ich usunięcie przez filtrację lub sedymentację. Cykl peroksydazy przedstawiony w badaniu pokazuje, jak generowane są reaktywne rodniki, które następnie łączą się nieenzymatycznie przez wiązania C-C (wiązania N-C są możliwe, ale mniej prawdopodobne ze względu na zatłoczenie steryczne) z orientacją orto- i para-, tworząc dimery, które rosną analogicznie z dodatkowymi cyklami peroksydazy, aż osiągną limit rozpuszczalności i wytrącą się.

Badacze przeprowadzili szczegółową analizę skuteczności tej metody, optymalizując kluczowe parametry operacyjne: pH, stężenie nadtlenku wodoru i aktywność enzymu. Celem było osiągnięcie co najmniej 95% skuteczności usuwania obu leków z wody. Czy ta metoda mogłaby stanowić przełom w oczyszczaniu wód z pozostałości farmaceutyków? Jakie korzyści przyniosłoby jej wdrożenie na szeroką skalę?

Wyniki badań wykazały, że optymalne pH dla enzymatycznej konwersji DCF wynosi 5,0. Poniżej tej wartości DCF wytrącał się z roztworów reakcyjnych, co można przypisać jego wartości pKa wynoszącej 4,18 – protonowana forma kwasu karboksylowego jest znacznie mniej rozpuszczalna niż karboksylan. Na przykład, przy pH 5,0 100% 0,10 mM DCF było rozpuszczalne, podczas gdy przy pH 3,0 tylko 22% związku pozostawało w buforowanym roztworze reakcyjnym. W przypadku ACF, który nie miał problemów z rozpuszczalnością, najlepszą konwersję osiągnięto w zakresie pH 3,0-4,6, z optimum przy pH 4,0. Dla obu substancji konwersja stawała się coraz gorsza wraz ze wzrostem pH powyżej wartości pKa, prawdopodobnie z powodu zwiększonej jonizacji grupy karboksylowej do formy anionowej substratu, która nie jest w stanie uczestniczyć w cyklu peroksydazy.

Optima pH dla DCF i ACF pokazują, że SBP przekształca te aniliny w warunkach łagodnie kwaśnych, co zaobserwowano również dla innych związków anilinowych, takich jak fenylenodiaminy, benzydyna i 4-chloro-o-toluidyna, które wykazywały podobne trendy, z odpowiednimi optima przy pH 4,5-5,6, 5,0 i 4,4-5,0. Przy pH > 7,0 niemal nie obserwowano usuwania tych związków. Tę samą wrażliwość na pH stwierdzono dla katalizowanej przez lakkazę konwersji DCF.

Interesujące różnice zaobserwowano również w wymaganiach dotyczących aktywności enzymu. Dla 0,10 mM DCF, minimalna skuteczna aktywność SBP wynosiła 0,15 U/mL, co pozwoliło osiągnąć 96% konwersji. Jest to zgodne z wymaganiami 0,10 i 0,15 U/mL dla optymalnej konwersji SBP 0,1 mM 4,4′-metylenobis(2-chloroaniliny) i 4,4′-tiodianiliny. Dalsze zwiększanie aktywności enzymu powodowało bardzo powolny wzrost procentowego usunięcia, więc użycie 0,30 U/mL SBP skutkowało jedynie ~98% usunięciem substratu z roztworu. Oznacza to, że podwojenie aktywności enzymu przyczyniło się jedynie do dodatkowego ~2% wzrostu wydajności, co nie uzasadniałoby zwiększonych kosztów enzymu.

Optymalne stężenie nadtlenku wodoru ustalono na 0,40 mM dla DCF i 0,45 mM dla ACF, osiągając odpowiednio minimum 3,4% i 4,2% pozostałego substratu. Zwiększenie stężenia H₂O₂ powyżej tych wartości skutkowało niższą wydajnością usuwania, prawdopodobnie z powodu inaktywacji SBP poprzez tworzenie związku III (odwracalnie nieaktywnego katalitycznie) w obecności nadmiaru H₂O₂ lub konwersję do nieodwracalnie nieaktywnej pochodnej P-670.

Co mówią dane kinetyczne i spektrometryczne o procesie oczyszczania?

Badania kinetyki reakcji wykazały, że początkowe stałe szybkości reakcji pseudo-pierwszego rzędu dla DCF i ACF wynosiły odpowiednio 0,484 ± 0,010 i 0,823 ± 0,020 min⁻¹, co przekłada się na czasy półtrwania 1,43 ± 0,01 i 0,84 ± 0,05 min. Po znormalizowaniu względem aktywności enzymu, czasy półtrwania wynosiły 0,22 ± 0,02 min na U/mL SBP dla DCF i 0,49 ± 0,01 min na U/mL SBP dla ACF. Znormalizowana początkowa stała szybkości reakcji katalitycznej dla DCF jest więc około dwukrotnie większa niż dla ACF. Ta przewaga kinetyczna DCF jest zgodna z wymaganiami enzymatycznymi dla 95% konwersji, o których wspomniano wcześniej.

W badaniach kinetycznych zaobserwowano, że oba związki osiągnęły ponad 95% konwersji; prawie 86% DCF zostało przekształcone w ciągu pierwszych 30 minut, ale konwersja pozostałych 11% zajęła 2,75 godziny. ACF osiągnął 88% konwersji po 30 minutach, a tylko 8% poprawy wydajności oczyszczania nastąpiło po pierwszych 30 minutach do końca. Spowolnienie tempa reakcji jest logiczne, ponieważ aktywność aktywnego enzymu zmniejszała się z czasem, co przypisuje się postępującej inaktywacji enzymu.

Analiza spektrometrii masowej potwierdziła tworzenie się produktów oligomeryzacji podczas enzymatycznego oczyszczania. W przypadku DCF wykryto utleniony tetramer, a także protonowane wolne kwasy, które potwierdzają utratę Na w warunkach reakcji, co prowadzi do utworzenia wolnej grupy funkcyjnej kwasu karboksylowego (-COOH). Zaobserwowano również częściowo zdechlorowany, protonowany utleniony tetramer (M₄H-6-3Cl), co wskazuje, że proces dechlorowania zachodzi podczas reakcji enzymatycznej, a nie jest wynikiem warunków MS, ponieważ standard nie wykazuje utraty Cl w analizie MS. Utrata chloru była wcześniej raportowana dla chlorowanych fenoli i ich wiązania z kwasem humusowym podczas enzymatycznej polimeryzacji.

Nie znaleziono dowodów na tworzenie się dimerów i trimerów. Można założyć, że brak tych oligomerów wynika z faktu, że są one łatwiej przekształcane w wyższe oligomery, tj. tetramery, niż konwersja monomeru w więcej dimerów podczas reakcji enzymatycznej. Istnieje precedens dla takich konkurencyjnych ścieżek w katalizowanej przez HRP oligomeryzacji fenolu – jednego z oczekiwanych dimerów, 4-fenoksyfenolu, nie znaleziono w mieszaninie reakcyjnej, ponieważ jego stała szybkości reakcji pseudo-pierwszego rzędu dla konwersji przez enzym była 160-krotnie wyższa niż dla fenolu macierzystego.

Jakie korzyści dla zdrowia publicznego niesie ta nowatorska metoda?

Wyniki tych badań mają istotne znaczenie dla praktyki medycznej i zdrowia publicznego. Lekarze powinni być świadomi zagrożeń związanych z obecnością NLPZ i ich metabolitów w środowisku oraz możliwych konsekwencji zdrowotnych. Metoda enzymatycznego oczyszczania z wykorzystaniem SBP oferuje obiecującą, ekologiczną alternatywę dla konwencjonalnych metod oczyszczania, co może przyczynić się do poprawy jakości wody i zmniejszenia ryzyka zdrowotnego związanego z chroniczną ekspozycją na te substancje.

“Surowa peroksydaza z łupiny nasion soi skutecznie katalizowała konwersję DCF i ACF w ekologiczny i zrównoważony sposób” – podsumowują badacze. Dzięki dostępności SBP w ogromnych ilościach jako produktu ubocznego przetwarzania największej na świecie uprawy nasion, leczenie oparte na SBP zapewnia opłacalną alternatywę dla konwencjonalnych procesów usuwania tych związków ze ścieków, osiągając >95% skuteczności usuwania. Wymagania SBP i H₂O₂ dla takiego usunięcia tych związków były znacznie niższe niż dla wielu innych związków aromatycznych badanych wcześniej.

Przyszłe badania będą ukierunkowane na zastosowanie tej metody w praktycznych warunkach, z rzeczywistymi stężeniami DCF i ACF w ściekach oczyszczalni. Czy ta innowacyjna metoda enzymatyczna stanie się standardem w oczyszczaniu wód z pozostałości farmaceutyków? Czas pokaże, ale wyniki są niezwykle obiecujące dla ochrony naszego środowiska wodnego i zdrowia publicznego.

Podsumowanie

Niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ) są powszechnie stosowane w medycynie, jednak ich obecność w środowisku wodnym stanowi poważny problem ekologiczny. Konwencjonalne metody oczyszczania ścieków nie są skuteczne w ich usuwaniu, co prowadzi do akumulacji tych substancji w wodach powierzchniowych i gruntowych. Naukowcy opracowali metodę enzymatycznego oczyszczania wody z wykorzystaniem peroksydazy z łupiny nasion soi (SBP), która wykazuje ponad 95% skuteczność w usuwaniu diklofenaku (DCF) i aceklofenaku (ACF). Optymalne warunki procesu obejmują pH 5,0 dla DCF i 4,0 dla ACF oraz stężenie nadtlenku wodoru 0,40-0,45 mM. Badania kinetyczne wykazały szybką konwersję w pierwszych 30 minutach reakcji, a analiza spektrometryczna potwierdziła tworzenie się produktów oligomeryzacji. Metoda ta stanowi ekologiczną i ekonomiczną alternatywę dla konwencjonalnych procesów oczyszczania, wykorzystując dostępny produkt uboczny przemysłu sojowego.